Nov pristop za hitro določitev specifičnosti proteaz in pripravo biomedicinskih proteaznih testov
Sodelavci Odseka za biokemijo, molekularno in strukturno biologijo Instituta »Jožef Stefan« in centra odličnosti »CIPKeBiP« Robert Vidmar, Matej Vizovišek, Dušan Turk, Boris Turk in Marko Fonović so opisali novo proteomsko metodo DIPPS, ki omogoča zelo hitro, učinkovito in zanesljivo določevanje specifičnosti proteaz v širokem območju eksperimentalnih pogojev. Proteaze so encimi z veliko uporabnostjo v kliničnih raziskavah in biotehnologiji, zato je poznavanje specifičnosti osnova za razumevanje njihovega delovanja in razvoj novih aplikacij. Zaradi svoje vsestranskosti je metoda DIPPS (Direct In-gel Profiling of Protease Specificity) izjemno uporabna v farmaciji pri razvoju testov za spremljanje aktivnosti proteaz, v biotehnoloških raziskavah pri testiranju biotehnološko uporabnih proteaz v ekstremnih pogojih in v biomedicini pri razvoju molekularnih orodij za študij proteaz. Raziskava je bila objavljena v ugledni znanstveni reviji EMBO Journal.
Proteaze so encimi, ki razgrajujejo proteine in s tem vplivajo na različne fiziološke procese. Nepravilno delovanje proteaz je povezano z nastankom številnih bolezenskih stanj, zato farmacevtska industrija inhibitorje proteaz že uspešno uporablja kot zdravila za bolezni kot so AIDS, hipertenzija, tromboza in nekatere oblike raka, še več pa jih je v različnih stopnjah kliničnih testiranj. Inhibitorji proteaz tako predstavljajo pomemben del proizvodnje zdravil. Za njihov uspešen razvoj so bistvenega pomena tudi hitri in občutljivi testi aktivnosti tarčnih proteaz, za katere pa je potrebno natančno poznavanje njihove substratne specifičnosti. To dejansko pomeni, da je potrebno določiti, katere peptide proteaza lahko cepi in kakšno zaporedje aminokislin v okolici mesta cepitve prepozna. Trenutne metode, ki so na voljo za takšne študije, so dolgotrajne in eksperimentalno zapletene poleg tega pa zaradi različnih tehničnih omejitev pogosto ne dajo dovolj zanesljivega rezultata.
Z uporabo masne spektrometrije je raziskovalna skupina na Institutu »Jožef Stefan« razvila nov pristop, imenovan DIPPS (Direct In-gel Profiling of Protease Specificity), ki omogoča izjemno zanesljivo določevanje substratne specifičnosti proteaz, opraviti pa ga je mogoče v samo dveh dneh. Metoda temelji na proteolitski cepitvi kompleksnega proteinskega vzorca v akrilamidnem gelu, ki ji sledi obogatitev cepljenih peptidov in njihova identifikacija z masno spektrometrijo. Za razliko od vseh primerljivih metod le-ta ne uporablja kemijskega označevanja in kromatografske ločitve, kar poenostavi delo ter izboljša občutljivost in statistično zanesljivost metode. Metoda DIPPS je tudi edina, ki omogoča določitev specifičnosti proteaz, ki delujejo v ekstremnih razmerah kot so visoke temperature (50-100°C) ter v kislem oziroma bazičnem okolju.
Pristop, ki je v celoti plod domačega znanja, je sprožil veliko zanimanje v mednarodnih znanstvenih krogih. Takoj po objavi je raziskovalno skupino kontaktirala tudi ena izmed vodilnih svetovnih farmacevtskih družb in izrazila interes za njeno uporabo.
