Pages Menu
TwitterRssFacebook
Categories Menu

Posted on 17.07.17 in Featured, Inštituti

dr. Marko Petek, NIB: Nova generacija pesticidov na osnovi RNA interference

dr. Marko Petek, NIB: Nova generacija pesticidov na osnovi RNA interference

„Biopesticidi so kot naravne snovi biorazgradljivi in se v nasprotju z nekaterimi sintetičnimi pesticidi ne kopičijo v naravi, prav tako njihovi razpadni produkti načeloma niso škodljivi za okolje“, razloži dr. Marko Petek, raziskovalec na Naciolnem inštitutu za biologijo (NIB). V okviru slovenskega raziskovalnega projekta kot podoktorski raziskovalec proučuje molekularne interakcije med različnimi genotipi krompirja, virusom PVY in koloradskim hroščem in je edini na omenjenem projektu na Oddelku za biotehnologijo in sistemsko biologijo. Z diplomo farmacevta in doktoratom iz biotehnologije svoje raziskovalno vnemo usmerja na interakcijo med rastlino – škodljivci – patogenimi virusi. Področje, ki veliko obeta tudi pri  uporabi pridelave hrane in zaščite okolja, zahteva temeljito vrhunsko bazično raziskovanje, za kar pa so nacionalna sredstva občutno prenizka. Raziskovalci sami zato veliko časa porabijo za pisanje projektnih prijav (tudi v vedno hujši konkurenci za evropska sredstva) in preračunavanja ter pogajanja za cene materiala, opreme in storitev. A raziskovalne vneme in elokvence dr. Petku kljub vsemu ne manjka.

Marko Petek, pred nedavnim ste strokovni javnosti predstavili vaše raziskave biopesticidov. Vendar vas za slabše poznavalce tega področja prosim, da najprej pojasnite, kaj so pesticidi. O teh najpogosteje govorimo v povezavi z zaščito rastlin pred različnimi škodljivci.

Pesticidi so vse snovi in pripravki, ki se uporabljajo predvsem za zatiranje škodljivcev, nekatere tudi za odvračanje ali privabljanje škodljivcev v pasti. Najbolj pogosto jih razvrščamo glede na tarčni organizem. V povezavi z zaščito rastlin se največ uporabljajo insekticidi – za zatiranje žuželk, herbicidi – za kontrolo plevela in fungicidi – za zatiranje gliv. Lahko jih delimo tudi glede na način pridobivanja, na sintetične – pridobljene s kemično sintezo ter na biološke oz. biopesticide, kamor spadajo npr. mikroorganizmi, rastlinski izvlečki in biološke molekule.

Za biopesticide domnevamo, da so pri uporabi bolj diferencirani in morda manj škodljivi. Lahko nam to nekoliko bolj razložite tudi eventualno zmoto.

Kot sem omenil, predpona »bio« pri biopesticidih pomeni, da so proizvedeni v živih organizmih. Načeloma zato niso bolj ali manj škodljivi ali specifični od sintetičnih. Za primer lahko navedem piretrin, biopesticid, ki se pridobiva iz rastline z imenom dalmatinski bolhač. Gre za učinkovit naravni insekticid z zelo nizko toksičnostjo za ljudi in druge toplokrvne živali, vendar je zelo strupen za ribe in nekatere druge žuželke, npr. čebele. Nekateri biopesticidi imajo pa visoko stopnjo selektivne toksičnosti. Primer so proteini iz bakterije Bacillus thuringiensis imenovani Bt toksini, ki zatirajo specifično le določene družine žuželk. So pa biopesticidi kot naravne snovi biorazgradljivi in se v nasprotju z nekaterimi sintetičnimi pesticidi ne kopičijo v naravi, prav tako njihovi razpadni produkti načeloma niso škodljivi za okolje.

Z biopesticidi na osnovi RNA interference ste se začeli ukvarjati intenzivneje šele pred dobrim letom ali nekaj več. Najprej, kaj je RNA interferenca in kaj vas je pritegnilo k natančnejšemu raziskovanju?

Biopesticide na osnovi RNA interference (RNAi) sem v laboratoriju začel raziskovati šele s prejšnjim letom, ko sem pridobil podoktorski projekt ARRS. Sicer pa te raziskave spremljam že od začetka doktorskega dela, kar bo zdaj približno 10 let.

RNA interferenca je celični regulatorni mehanizem, ki prepreči translacijo informacijske RNA (mRNA) v protein. Molekule mRNA prenesejo zapis za določen gen iz dvoverižne DNA do ribosomov, kjer se sintetizirajo proteini. Te mRNA so enovprežne (angl. »single-stranded RNA«), medtem ko so za delovanje RNA interference potrebne dvoverižne molekule RNA (dsRNA, angl. »double-stranded RNA«). Slednje namreč v celici prepozna proteinski kompleks RISC in jih razreže na 21-24 nukleotidov. Ena od verig teh malih dsRNA se nato veže na kompleks RISC in deluje kot matrica za sekvenčno-specifično prepoznavo tarčnih molekul mRNA. Ko RISC kompleks prepozna tarčno mRNA jo bodisi razreže ali prepreči sintezo proteina iz te mRNA na ribosomu. Mehanizem zelo specifično cilja le določene gene in je prisoten pri večini evkariontskih organizmov. Njegove naravne funkcije v celici so obramba pred virusi, preprečevanje širjenja mobilnih genetskih elementov (npr. transpozonov) ter kontrola izražanja genov. Pri razvoju biopesticida na osnovi RNAi ciljamo na gene z življenjsko pomembno funkcijo pri npr. rasti, razvoju, razmnoževanju, kar pri uspešnem utišanju izražanja povzroči smrt škodljivca.

Mene je k raziskovanju tega področja pritegnila možnost uporabe RNAi tehnologije za potrditev funkcije oz. vloge določenih genov. V okviru doktorskega dela sem namreč raziskoval interakcije med geni izraženimi v prebavilih koloradskega hrošča in obrambnim odgovorom krompirja. Že takrat me je pa zelo pritegnila tudi možnost uporabe molekul dsRNA za zatiranje koloradskega hrošča. Ta je bil tudi eden prvih škodljivcev, na katerem so pokazali učinkovito zatiranje po hranjenju ličink z dsRNA.

RNA interferenco je znanost odkrila že pred nekaj desetletji. Je šlo za naključje?

Fenomen utišanja izražanja genov so že od sredine osemdesetih opazili v različnih poskusih, pri različnih organizmih – rastlinah, žuželkah in nematodih, vendar niso znali pojasniti mehanizma. Ti nepojasnjeni rezultati so spodbudili raziskave s sistematično uporabo znanstvenih metod in leta 1998 sta Fire in Mello prva v prestižni znanstveni reviji Nature objavila odkritje, da pri nematodi C. elegans utišanje genov sproži dsRNA in ne druge molekule. Kasneje so znanstveniki do podobnih ugotovitev prišli na drugih organizmih, odkrili posamezne proteine RICS kompleksa in pojasnili biokemijski mehanizem delovanja RNAi. Čisto vse seveda še ni znano, še vedno je ostalo nekaj podrobnosti in vprašanj, ki zaposlujejo novo generacijo znanstvenikov.

Sicer pa so se te raziskave potem zelo razmahnile tudi na druga področja, pripeljale celo do kliničnih študij za humano medicino. Kako je ta razvoj potekal?

Na tem področju je bil prehod iz bazične znanosti na aplikativno zelo hiter. Glede na to, da se je mehanizem RNAi v naravi najverjetneje razvil kot del imunskega odgovora na viruse, je prva in najbolj očitna aplikacija za zdravljenje virusnih obolenj. Ta aspekt so najprej komercialno realizirali pri rastlinah – že 1998 je na tržišče prišla transgena papaja »Rainbow papaya« odporna na uničujoč virus. Ko so odkrili mehanizem RNAi tudi pri sesalcih v začetku novega tisočletja, so se pojavile ideje za zdravljenje cele vrste človeških bolezni, od genetskih bolezni, virusnih okužb do zdravljenja raka. Nekaj učinkovin je sicer v fazi kliničnih testiranj, vendar kolikor vem, še vedno nobena ni na tržišču oz. v klinični uporabi.

Na katerem področju humane medicine so raziskave potekale in kakšni so bili obeti. So kasneje to področje opustili ali se razvija naprej?

Tega področja RNA interference ne spremljam tako podrobno, tako da ga težje komentiram. Obeti so bili na začetku vsekakor zelo veliki, vendar se je izkazalo, da je razvoj zdravila na osnovi RNAi velik izziv. Predvsem so problemi z učinkovito dostavo RNA molekul v celice, s stabilnostjo RNA v plazmi in imunskim odzivom. Vsekakor pa gre razvoj naprej in za nekatere bolezni lahko v naslednjih letih pričakujemo tudi registracijo zdravila na osnovi RNAi tehnologije.

Pomembnost teh raziskav dokazuje tudi Nobelova nagrada za medicino in fiziologijo. Se pravi, da imajo res velik potencial.

Nobelovo nagrado sta prejela prej omenjena Fire in Mello in sicer za odkritje, da pri nematodi oz. ogorčici Caenorhabditis elegans utišanje genov sprožijo molekule dsRNA in ne druge oblike nukleinskih kislin. Potencial RNAi tehnologije je velik, kot vsaka druga tehnologija pa ima določene omejitve, zaradi katerih jo, vsaj na nekaterih področjih, izpodrivajo novejše tehnologije, predvsem tehnologija CRISPR-Cas9.

Pred dobrimi desetimi leti pa je Monsanto vložil patent za RNAi metodo za zaščito rastlin pred škodljivci. Je imelo to kakšen odmev pri porabnikih? Tudi zato, ker Monsanto vsaj v Evropi ni na najboljšem glasu.

Tu je pomembno na koga mislite z uporabniki. Kupci Monsantovih semen so kmetje in pri teh odziva še ni bilo, ker semena s to tehnologijo še niso komercialno dostopna. Bo pa kmalu na trgu prva Monsantova koruza, ki proizvaja dsRNA za zaščito pred koruznim hroščem, in bomo videli kakšen bo njihov odziv. Če kot uporabnike mislite potrošnike, sem pa prepričan, da večina še ni slišala za RNA interferenco, so pa gotovo slišali za transgene rastline. V Evropi trenutno prevlada odpor do transgenih rastlin, tako da pričakujem, da se transgena semena z RNAi tehnologijo ne bodo dobro prodajala, če bodo sploh prišla na tržišče EU. Za aplikacijo dsRNA v obliki biopesticidnega pripravka za škropljenje sem pa nekoliko bolj optimističen in menim, da bi jih javnost tudi v EU sprejela. Odgovornost za oblikovanje javnega mnenja glede te tehnologije nosijo poleg podjetij, ki bodo proizvajala in tržila te produkte, tudi politika in mediji.

Kako pa RNAi deluje na celičnem nivoju. Biologi, ki proučujete RNAi natančno opazujete spremembe in dogajanje na celični ravni, najbrž do potankosti tu najprej ugotavljate vplive, spremembe…

Tako je. Dobra stran RNAi pesticidov (tudi zdravilnih učinkovin) je, da je njihovo načrtovanje relativno preprosto. Pomembno je le, da imamo sekvenciran genom tarčnega organizma, in da ima najdeno tarčni gen s specifičnim zaporedjem za katerega lahko načrtujemo dsRNA. V primeru biopesticida je pomembno, da načrtovana dsRNA utiša gen samo v izbranem tarčnem organizmu, npr. žuželki. Zato potrebujemo v fazi načrtovanja tudi genomska oz. transkriptomska zaporedja sorodnih vrst, ki jih ne želimo zatirati. Ker živimo v času, ko se neverjetno hitro povečuje število sekvenciranih genomov vzporedno pa narašča tudi hitrost računalniškega procesiranja, lahko specifičnost utišanja z načrtovano dsRNA predvidimo s pomočjo bioinformatskih analiz. V nadaljnjih fazah razvoja utišanje tarčnih genov in vpliv na netarčne gene pomerimo s transkriptomskimi metodami po tretmaju z dsRNA. Trenutno je najbolj zmogljiva transkriptomska metoda sekvenciranje RNA (RNAseq), s katero kvantificiramo izražanje vseh genov  v organizmu in ugotavljamo npr. odzive na različne odmerke dsRNA ali razvoj odziva skozi čas.

Vedno, ko se razpravlja o zaščiti rastlin ali živali z uporabo določenih substanc, se pojavi vprašanje varnosti oziroma škodljivosti. Kaj je že preizkušeno pri RNAi in je že v javni uporabi.

Dvoverižne RNA so prisotne v vseh celicah, saj regulirajo izražanje naših genov. Prav tako je genom določenih rastlinskih virusov v obliki dsRNA, kar pomeni, da dsRNA rastlinskega in virusnega izvora nehote vsakodnevno uživamo s hrano. O varnosti RNAi biopesticidov se veliko govori tudi v znanstvenih krogih, zato je bilo narejenih razmeroma veliko študij za oceno tveganja tehnologije. Ameriška agencija EPA in evropska EFSA sta že obravnavali to tehnologijo in pripravili osnutke ocene tveganja. V ZDA je EPA za transgeno koruzo MON 87411, ki proizvaja dsRNA za zatiranje koruznega hrošča, ocenila, da je tveganje za okolje in zdravje ljudi nizko in dovolila registracijo za namen razmnožitve semena.

Če omenim samo nekaj študij – pokazali so, da dsRNA za zatiranje koruznega hrošča ni toksična za čebele. Pri sesalcih se ta dsRNA v prebavnem traktu zelo hitro razgradi in je niso zaznali v krvnem obtoku. Pri nanosu na rastline v obliki spreja so se te molekule popolnoma razgradile v nekaj dneh, v zemlji manj kot v dveh dneh. Nestabilnost dsRNA v naravnem okolju in v prebavilih žuželk zato predstavlja velik izziv za komercializacijo RNAi pesticidov v obliki škropiv.

V tem kontekstu se v javnosti pojavlja vprašanje ali ti načini vplivajo na genske spremembe pri rastlini, kar del javnosti odločno zavrača. 

V primeru škropljenja dsRNA na rastline ne pride do privzema teh molekul v rastlinske celice, torej je odgovor ne. V primeru rastlin, ki same proizvajajo načrtovane dsRNA, pa imamo transgeno oz. gensko spremenjeno rastlino. So pa tarčni geni dsRNA v žuželki, zato ta na izražanje rastlinskih genov nima vpliva.

Glede na učinkovitost RNAi tehnologije ta gotovo omogoča širšo komercializacijo pri zaščiti rastlin. Kakšni so obeti?

Širša komercializacija je možna, ugotovitve pa kažejo, da ta tehnologija za nekatere škodljivce najverjetneje ne bo dovolj učinkovita. Pri veliko škodljivih žuželkah so namreč odkrili, da slabo privzemajo dsRNA skozi prebavila ali da imajo v slini, prebavnih sokovih ali hemolimfi encime, ki zelo hitro razgradijo dsRNA. Pri teh s samo dsRNA ni možno doseči stopnje utišanja genov, ki bi povzročili pesticidno delovanje. Znanstveniki zato preučujejo dostavne sisteme, ki bi zaščitili dsRNA pred hitro razgradnjo in povečali privzem dsRNA v celice prebavil.

Biopesticide na osnovi RNAi proučujete tudi na Oddelku za biotehnologijo in sistemsko biologijo na NIBu, do kakšnih ugotovitev ste prišli?

Na našem oddelku se s tem področjem trenutno ukvarjam sam. V okviru omejenih sredstev podoktorskega projekta sem načrtoval in testiral dsRNA za utišanje izraženja treh genov v prebavilih koloradskega hrošča. Ena od teh dsRNA se je izkazala za zelo učinkovito, vendar so me s prijavo patenta prehiteli raziskovalci iz industrije. Drugi dve še testiram v prehranjevalnih testih. Za podroben vpogled v mehanizem delovanja teh biopesticidov bom preučil tudi učinek pesticidne dsRNA na transkriptom in metagenom prebavil koloradskega hrošča.

Če ima tehnologija RNAi res velik aplikativen potencial boste raziskave razširili in poglobili?

Vsekakor obstaja želja, da bi z raziskavami na tem področju nadaljeval. Je pa to seveda odvisno od financiranja oziroma uspešnosti pri prijavah na razpise za raziskovalne projekte na nacionalni in mednarodni ravni.

Raziskovalci ste danes redki samohodci, za učinkovitost novih spoznanj se vedno bolj povezujete, tudi v mednarodnem okolju. So vaše raziskave vpete v tak način raziskovanja in kako se s tem spopadate?

Na oddelku se vsi trudimo, da sodelujemo in iščemo sinergije s slovenskimi in tujimi raziskovalci. Na tematiki biopesticidov na osnovi RNAi zato sodelujemo v evropski COST akciji iPlanta (http://iplanta.univpm.it/), katere namen je povezovanje raziskovalcev, ki se ukvarjamo z načini in mehanizmi zaščite rastlin na osnovi RNA interference. Pred nekaj leti smo prijavljali tudi bilateralni projekt s skupino univerze v Nebraski, vendar nismo bili uspešni. Z namenom iskanja partnerjev in novih idej za projekte se udeležujem tudi tematskih mednarodnih kongresov. Ta druženja so po mojem mnenju zelo pomembna, saj je veliko lažje sodelovati v projektih z nekom, s katerim prej navežeš osebni stik.

Za znanost v Sloveniji zadnja leta pesti nenehno zmanjševanje raziskovalnega denarja. Pogosto je od tega odvisna tudi usoda raziskav in raziskovalcev samih. Glede na to, da sodite med mlajšo generacijo, kako doživljate take razmere.

Trenutne razmere v znanosti so pri nas zaskrbljujoče. Nacionalna sredstva namenjena znanosti so občutno prenizka za izvajanje vrhunskih bazičnih raziskav, na evropskih projektnih razpisih pa je konkurenca vedno večja in je zelo težko predvideti uspešnost prijav. Veliko časa zato raziskovalci namesto za raziskave v laboratoriju porabimo za pisanje projektnih prijav in preračunavanja ter pogajanja za cene materiala, opreme in storitev. Pomanjkanje sredstev na raziskovalnih inštitucijah se kaže tudi v tem, da imamo mlajši sodelavci v večini pogodbe za določen čas za obdobje 1- 4 let, ki nam ne omogočajo npr. najema stanovanjskega kredita. To je vsaj zame zelo ponižujoče in verjamem, da tudi ostalim kolegom povzroča stres in frustracije. Ko na oddelku ne uspemo pridobiti novih projektov, smo mladi primorani iskati službo drugje in vsaj za nekaj časa izgubimo stik z raziskovalnim področjem. Na ta način je dolgoročno težko dosegati dobre raziskovalne rezultate, še manj pa le-te pripeljati do končnega izdelka.

Foto: osebni arhiv

 

Post a Reply

Your email address will not be published. Required fields are marked *