Pages Menu
TwitterRssFacebook
Categories Menu

Posted on 8.06.19 in Svet

Vpeljava novih metod za določanje količine GSO v živilih

Vpeljava novih metod za določanje količine GSO v živilih

NIB (Nacionalni inđtitut za biologijo), je kot nacionalni referenčni laboratorij za  testiranje GSO,  vpeljal nove metode za določanje GSO v živilih.

Živila in krma, ki vsebujejo gensko spremenjene organizme (GSO), morajo biti v Sloveniji in v EU obvezno označeni, če vsebujejo več kot 0,9 % odobrenih GSO. Prisotnost neodobrenih GSO ni dovoljena. Za ustrezen nadzor nad gojenjem in trgovanjem z GSO je treba razviti metode, ki omogočajo zanesljivo določanje deleža GSO v posameznem vzorcu. S povečevanjem kompleksnosti živil in krme, ki vsebujejo vse več sestavin in so močno predelani, so postali postopki za določanje deleža GSO v vzorcih vse bolj zahtevni.

Proces določanja deleža GSO lahko primerjamo z določanjem količine rjavega fižola v mešanici fižola različnih barv. Če želimo izračunati delež rjavega fižola v mešanici, moramo prešteti tako število zrn rjavega fižola kot tudi število vseh zrn v mešanici. Podobno moramo pri postopku določanja deleža GSO v vzorcu prešteti tako zaporedja DNK, ki so značilna za GSO kot tudi zaporedja DNK, ki so značilna za posamezno biološko vrsto.

Za razliko od štetja zrn fižola pa štetje zaporedij DNK oziroma določanje njihove količine ni enostavno. Da bi jih sploh lahko šteli, jih moramo najprej pomnožiti po posebnem postopku, imenovanem verižna reakcija s polimerazo (PCR).

Ena izmed različic PCR, ki omogoča določanje količine DNK, je verižna reakcija s polimerazo v realnem času (qPCR). Pri qPCR določamo količino DNK v vzorcu tako, da z ustreznim začetnim zaporedjem nukleotidov pomnožujemo izbrane dele oziroma zaporedja DNK. Iz dobro ovrednotenega referenčnega materiala, ki vsebuje iskana zaporedja DNK, pripravimo umeritveno krivuljo, ki jo primerjamo s krivuljami vzorcev. Tak pristop nam omogoča, da določimo količino izbranih zaporedij DNK v vzorcu. V primeru določanja GSO moramo tako analizo narediti dvakrat, ker je potrebno pomnožiti dve različni zaporedji: zaporedje značilno za GSO in zaporedje značilno za biološko vrsto. Delež GSO nato določimo s primerjavo izmerjenih količin obeh zaporedij.

Žal pa metoda qPCR ni primerna za vse vrste vzorcev, saj ni dovolj zanesljiva pri vzorcih, ki vsebujejo nizke količine DNK ali preveč nečistoč, ki zmanjšujejo učinkovitost qPCR in s tem pomnoževanja DNK. Z novim pristopom, ki so ga razvili v zadnjih letih in ga poimenovali digitalna verižna reakcija s polimerazo (dPCR), se je možnost zanesljivega določanja količine DNK povečala.

Pri dPCR razbijemo vzorec na tako majhne podvzorce, da je v vsakem podvzorcu le po en del DNK. V praksi jih je sicer lahko tudi več, a znamo takšne primere ustrezno ovrednotiti s pomočjo statistične analize. Nato vsakega od podvzorcev pomnožimo po metodi PCR. Ker z ustreznimi začetnimi zaporedji DNK poskrbimo, da se bo pomnoževalo samo iskano zaporedje DNK, bo do pomnoževanja prišlo samo v podvzorcih, v katerih je iskana DNK.

Pri dPCR za določanje količine DNK ne potrebujemo primerjave z referenčnimi materiali, saj lahko po izvedeni reakciji preštejemo vse podvzorce, ki so se pomnožili, ter tako določimo količino iskane DNK v vzorcu. Pri določanju GSO na tak način določimo količino DNK značilne za GSO in količino DNK, ki je lastna oziroma značilna za posamezno biološko vrsto. Razmerje teh dveh števil ustreza deležu gensko spremenjene DNK v vzorcu.

Na osnovi dolgoletnega preučevanja metod za kvantifikacijo nukleinskih kislin, so raziskovalci Nacionalnega inštituta za biologijo v Ljubljani pokazali, da je metoda dPCR lahko pomembno orodje za določanje deleža GSO predvsem v kompleksnih vzorcih.

V študiji so preverili občutljivost in točnost metode dPCR na gensko spremenjeni liniji soje, ki se komercialno imenuje Roundup Ready. Pokazali so, da imajo različne metode ekstrakcije oziroma čiščenja nukleinskih kislin zelo velike učinke na metodo qPCR, ne pa na metodo dPCR. Metoda dPCR je zato primerna tudi za bolj zahtevne vzorce, v katerih je več nečistoč, zelo malo DNK ali pa je DNK delno razpadla. Na takih vzorcih deleža gensko spremenjene soje s qPCR ne moremo določiti, z dPCR pa lahko.

»Tehnologija se je izkazala za izjemno robustno, a hkrati dovolj občutljivo, kar je idealno za določanje deleža GSO v kompleksnih vzorcih«, je povedala dr. Alexandra Bogožalec Košir, prva avtorica raziskave.

»Ker smo nacionalni referenčni laboratorij za testiranje GSO, smo želeli najti metodo, ki bi jo lahko uporabili za kompleksne vzorce, kjer deleža GSO ne moremo določiti z uporabo standardnega pristopa qPCR«, je dodala dr. Mojca Milavec, koordinatorka študije.

Foto: NIB

Post a Reply

Your email address will not be published. Required fields are marked *